Efeito do derivado N-acilidrazônico LASSBio-897 sobre a resposta inflamatória pulmonar na asma e silicose experimentais / Effect of the N-acylhydrazone derivative LASSBio-897 on pulmonary inflammatory response in experimental asthma and silicosis

Doenças pulmonares crônicas, como a asma e a silicose, são caracterizadas por inflamação das vias aéreas e fibrose que levam à marcada deterioração da função pulmonar. O objetivo da presente tese é investigar o impacto das propriedades anti-inflamatórias e antifibróticas do composto LASSBio-897 na asma e silicose experimental. Utilizaram-se metodologias diversas, incluindo a quantificação da reatividade de vias aéreas por pletismografia barométrica, além da quantificação do teor tecidual de mediadores inflamatórios por ELISA e do infiltrado celular pulmonar com técnicas de histologia e imunohistoquímica. Foram ainda quantificados a produção de citocinas por fibroblastos e macrófagos “in vitro”. O tratamento oral profilático com LASSBio-897 (2 e 5 mg/kg) preveniu a instalação do quadro de hiper-reatividade brônquica, o infiltrado celular e a geração de citocinas pró-inflamatórias em modelos de asma aguda em camundongos. Por outro lado, o tratamento mostrou-se inativo quando feito após a instalação da resposta asmática. Resultados mais promissores foram obtidos na condição da silicose experimental, onde o tratamento oral terapêutico com LASSBio-897 (2 e 5 mg/kg) claramente inibiu o comprometimento da função pulmonar, o processo inflamatório e a fibrose observados induzidos pela exposição à sílica. O composto não interferiu com a atividade de mastócitos e células epiteliais estimuladas com sílica “in vitro”. No entanto, a administração de LASSBio-897 reduziu a expressão de F4/80 e alfa-SMA no tecido pulmonar de animais silicóticos, evidenciando assim sua atividade sobre macrófagos e miofibroblastos, respectivamente. Ensaios “in vitro” confirmaram esse efeito, uma vez que o composto reduziu a liberação de TNF-alfa por macrófagos alveolares estimulados com sílica e inibiu a proliferação e produção de colágeno induzida por IL-13 em fibroblastos pulmonares oriundos de animais silicóticos...

Chronic lung diseases such as asthma and silicosis are characterized by airwayinflammation and fibrosis leading to marked deterioration of lung function. The aim of this thesis is to investigate the effect of compound LASSBio-897 onexperimental asthma and silicosis. Various pathological parameters wereassessed, including airway hyper-reactivity by barometric plethysmography,lung tissue content of inflammatory mediators by ELISA and cellular infiltrationusing histology and immunohistochemistry techniques. Cytokine generationfrom fibroblasts and macrophages in vitro was also quantified. Oral prophylactictreatment with LASSBio-897 (2 and 5 mg/kg) prevented airway bronchial hyperreactivity,leukocyte recruitment and cytokine generation in a model of acuteasthma in mice. However, this treatment was inactive when performed afterinstallation of the asthmatic response. More promising results were obtained inthe experimental silicosis condition, where the LASSBio-897 therapeutictreatment (2 and 5 mg/kg, oral) clearly inhibited airway hyper-reactivity, as wellas inflammation and peribronchial fibrosis induced by silica particles.Furthermore, LASSBio-897 did not interfere with mast cells and epithelial cellsactivity after silica stimulation in vitro. However, LASSBio-897 clearly reducedF4/80 and alfa-SMA expression in the lung of silicotic mice, showing its inhibitoryeffect on macrophages and myofibroblasts, respectively. In vitro assaysconfirmed this effect, since the compound reduced TNF-alfa release by analveolar macrophage cell lineage after silica exposure, and inhibitedproliferation and collagen production induced by IL-13 in lung fibroblastsrecovered from silicotic mice...

Inflamação alérgica modifica o fenótipo e a funcionalidade de fibroblastos pulmonares em cultura 3D / Allergic inflammation modifies the phenotype and functionality of lung fibroblasts in 3D culture

A fibrose subepitelial é uma característica marcante do remodelamento pulmonar observado na asma. Esse fenômeno está fortemente relacionado ao declínio da função pulmonar, mas sua base mecanística é ainda pouco compreendida. Uma vez que os fibroblastos pulmonares são as principais células estruturais que orquestram o remodelamento fibrótico na asma, neste estudo comparamos as alterações morfológicas e funcionais de fibroblastos pulmonares de camundongos sadios e asmáticos, cultivados em um arranjo celular tridimensional organizado (esferóides). A idéia central foi a obtenção de esferóides de fibroblastos pulmonares como um sistema alternativo para o estudo do remodelamento do tecido pulmonar in vitro. Camundongos Balb/c foram desafiados com ovoalbumina ou salina três vezes por semana durante duas semanas consecutivas, 30 dias após a sensibilização. Passadas 24 h após a última provocação antigênica, células resultantes da digestão pulmonar foram cultivadas, e uma cultura homogênea de firoblastos pulmonares foi obtida (em terceira passagem) e cultivada em placas de 96 poços tratadas com agarose, na presença ou ausência de IL-13 (10-80 ng/mL). A fibrose subepitelial, o infiltrado leucocitário, a liberação de citocinas, a produção de colágeno, e fibronectina foram avaliados através de colorações específicas, ELISA, Sircol e imunomarcação, respectivamente. Observamos que a provocação alergênica conduz a uma marcada resposta inflamatória pulmonar predominantemente eosinofílica, e sinais expressivos de remodelamento das vias aéreas e deposição de proteínas de matriz. Essas mudanças foram acompanhadas pela elevação dos níveis de IL-13, eotaxina-1, IL-4 e IL-5, mensuradas em amostras de tecido pulmonar. Nós também observamos que fibroblastos obtidos de camundongos sadios (pulmão controle) ou camundongos ativamente sensibilizados e desafiados (pulmão remodelado) formaram esferóides em 24 h de cultivo. Esferóides de fibroblastos de pulmão controle apresentaram menor tamanho e expressam menos componentes de matriz (fibronectinaa e colágeno), quando comparados a esferóides de pulmões remodelados. Interessantemente, esferóides controle expostos à IL-13 assemelharam-se àqueles formados por fibroblastos de pulmões remodelados, particularmente em relação à maior geração de fibronectina, colágeno e eotaxina-1. em conclusão, estes resultados mostram que o cultivo de esferóides formados por fibroblastos pulmonares de camundongos antigenicamente desafiados exibem diferenças fenotípicas e morfológicas, relacionadas ao reparo tecidual e remodelamento das vias aérias, reforçando a idéia de que mudanças adquiridas por fibroblastos durante eventos de remodelamento possam persistir em gerações futuras dessas células, contribuindo para a patogênese da asma.